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简单却易错的反转录…

2022-05-17 766
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后续来了…

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师兄师兄,反转录真的好简单啊,操作说明都只有豆腐大一块,提RNA的有两三页呢!

是不是觉得组分一加、模板一加,上机,so easy?

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是啊是啊,就这我还能出错?

哦,这么自信?那我考考你,反转录体系组成都有哪些?

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这个我知道!酶、buffer、引物、模板RNA、无酶水!

可以的嘛,现在大多试剂盒都提供预混Mix了,我们只需要加引物、模板、水就可以了。那么,模板用量是多少你知道不?

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…随便加点?

这?!…要不要去基因组RNA?

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要,…还是不要?

算了吧你…来,师兄给你好好说说。

一般来说,反转录模板RNA添加量要严格按照产品说明书建议用量添加,过多会抑制反转录效率,过少会使下游PCR、qPCR实验cDNA模板量过低。而且,要注意根据提取纯化的RNA浓度调整添加体积哦。

如果你下游实验为qPCR,可以使用福际生物的RT Easy II,这个是qPCR专用第一链cDNA合成试剂盒,预混了优化配比的Oligo(dT)引物与随机引物,可以省略添加引物的步骤。

但你的研究样本是miRNA,就要根据说明书建议量添加你自己合成的特异性引物。

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哦,我明白了。那我做的是RNA,怎么又扯上基因组DNA了呢?

传统方法提取RNA的过程中极易混入少量基因组DNA,因此在后续检测过程中有可能出现假阳性现象,会影响对后续实验结果的判断。这时你就要考虑去除残留的基因组DNA。

可以设置无反转录对照(no-RT control)——即含有除反转录酶以外的所有成分——来确定是否存在基因组DNA干扰。

要避免残留基因组DNA对实验结果的影响,可以在提取时使用DNA去除效果好的福际总RNA提取试剂盒;或者使用去基因组的反转录产品,比如福际的RT Easy II (with gDNase)?;褂幸恢址椒ㄊ巧杓瓶缒诤右?,也可以达到避免基因组DNA干扰的目的。

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哦,原来反转录还有这么多坑,谢谢师兄,我去做实验了~

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